Spektrofotometrija je eksperimentalna tehnika, ki se uporablja za merjenje koncentracije topljene snovi v določeni raztopini z izračunom količine svetlobe, ki jo ta snov absorbira. Ta tehnika je zelo uporabna, ker nekatere spojine absorbirajo tudi različne valovne dolžine svetlobe z različno jakostjo. Z analizo svetlobe, ki prehaja skozi raztopino, lahko ugotovite spojine, raztopljene v raztopini, in njihove koncentracije. Orodje za analizo raztopin s to tehniko v laboratoriju je spektrofotometer.
Korak
1. del od 3: Priprava vzorca
Korak 1. Vklopite spektrofotometer
Večino spektrofotometrov je treba pred natančnimi meritvami ogreti. Zato zaženite stroj in ga pustite stati vsaj 15 minut, preden merite vzorec.
Ta čas uporabite za pripravo vzorca
Korak 2. Očistite kiveto ali epruveto
V šolskih laboratorijih so lahko na voljo epruvete za enkratno uporabo, ki jih ni treba najprej očistiti. Če pa uporabljate običajno kiveto ali epruveto, pred uporabo aparat temeljito očistite. Vse kivete sperite z deionizirano vodo.
- Pri uporabi kivet bodite previdni, saj so precej dragi.
- Med uporabo kivete se ne dotikajte strani, kjer svetloba prehaja (običajno čista stran posode).
Korak 3. V kiveto nalijte dovolj vzorca
Največja prostornina dela kivete je 1 ml, največja prostornina epruvete pa 5 ml. Vaše meritve morajo biti natančne, dokler svetloba spektrofotometra še vedno lahko prehaja skozi vzorec in ne v praznem delu vsebnika.
Če za vstavljanje vzorcev uporabljate pipeto, za vsak vzorec uporabite novo konico. Tako se lahko izognemo navzkrižni kontaminaciji
Korak 4. Pripravite kontrolno raztopino
Te raztopine, znane tudi kot slepe ali slepe, vsebujejo samo topilo v raztopini, ki se analizira. Na primer, če imate vzorec soli, raztopljen v vodi, je slepa raztopina voda. Če je voda, ki jo uporabljate, rdeča, uporabite tudi rdečo slepo raztopino. S podobno posodo držite slepo raztopino v isti prostornini kot vzorec.
Korak 5. Obrišite zunanjost kivete
Preden vstavite kiveto v spektrofotometer, se prepričajte, da je čista, da se izognete motnjam pri meritvah zaradi delcev prahu ali nečistoč. S krpo, ki ne pušča vlaken, odstranite kapljice vode ali prah, ki se nalepi na zunanjo stran kivete.
2. del 3: Eksperimentiranje
Korak 1. Določite in prilagodite valovno dolžino svetlobe za analizo vzorca
Za večjo učinkovitost merjenja uporabite eno valovno dolžino svetlobe (enobarvni žarek). Izberite barvo svetlobe, ki jo lahko absorbira kemična vsebnost, ki naj bi se raztopila v preskusnem vzorcu. Nastavite valovno dolžino glede na specifikacije spektrofotometra, ki ga uporabljate.
- V šolskih laboratorijih bodo te valovne dolžine običajno navedene v poskusnih navodilih.
- Ker bo vzorec odseval vso vidno svetlobo, je valovna dolžina barve eksperimentalne svetlobe običajno vedno drugačna od barve vzorca.
- Predmet se zdi določene barve, ker odraža določeno valovno dolžino in absorbira vse druge barve. Trava je videti zelena, ker klorofil v njej odseva zeleno in absorbira druge barve.
Korak 2. Umerite spektrofotometer s slepo raztopino
Slepo raztopino vstavite v držalo kivete in zaprite spektrofotometer. Na zaslonu analognega spektrofotometra je igla, ki se bo premikala glede na intenzivnost zaznavanja svetlobe. Po vstavitvi slepe raztopine se mora igla premakniti v desno. Zapišite to vrednost, če jo boste pozneje potrebovali. Pustite, da slepa raztopina ostane v spektrofotometru, nato s pomočjo nastavitvenega gumba potisnite iglo na nič.
- Na enak način je mogoče umeriti tudi digitalne spektrofotometre. Vendar je to orodje opremljeno z digitalnim zaslonom. S krmilnim gumbom nastavite odčitek slepe raztopine na 0.
- Tudi če slepo raztopino odstranimo iz spektrofotometra, bo umerjanje še vedno veljavno. Torej, ko izmerite celoten vzorec, se bo absorpcija slepega dela samodejno zmanjšala.
Korak 3. Odstranite slepo snov in preizkusite rezultate kalibracije spektrofotometra
Tudi po odstranitvi slepe raztopine iz spektrofotometra mora igla ali številka na zaslonu še vedno kazati 0. Vstavite slepo raztopino nazaj v spektrofotometer in se prepričajte, da se odčitki ne spremenijo. Če je spektrofotometer pravilno umerjen s slepo raztopino, mora biti rezultat na zaslonu še vedno 0.
- Če igla ali številka na zaslonu ne odčita 0, ponovite korake umerjanja s slepo raztopino.
- Če težave ne odpravite, poiščite pomoč ali naj nekdo preveri spektrofotometer.
Korak 4. Izmerite absorpcijo vzorca
Odstranite slepo raztopino in vzorec vstavite v spektrofotometer. Počakajte približno 10 sekund, da se kazalci stabilizirajo ali se številke na digitalnem zaslonu prenehajo spreminjati. Zabeležite odstotek prepustnosti in/ali absorpcije vzorca.
- Več svetlobe, ki je prepuščena, manj svetlobe se absorbira. Običajno morate zabeležiti vrednost absorpcije vzorca, ki je na splošno izražena kot decimalno število, na primer 0,43.
- Meritev vsakega vzorca ponovite vsaj trikrat in nato izračunajte povprečje. Tako bodo rezultati, ki jih dobite, natančnejši.
Korak 5. Ponovite poskus z različnimi valovnimi dolžinami svetlobe
Vaš vzorec lahko vsebuje več spojin, ki imajo različne absorpcije, odvisno od valovne dolžine svetlobe. Za zmanjšanje negotovosti ponovite meritve vzorcev v intervalih valovnih dolžin 25 nm po celotnem svetlobnem spektru. Na ta način lahko v vzorcu zaznate druge raztopljene kemikalije.
3. del 3: Analiza podatkov o absorpciji
Korak 1. Izračunajte prepustnost in absorpcijo vzorca
Prehodnost je količina svetlobe, ki lahko prehaja skozi vzorec in doseže spektrofotometer. Medtem je absorpcija količina svetlobe, ki jo absorbira ena od raztopljenih kemikalij v vzorcu. Obstaja veliko sodobnih spektrofotometrov, ki oddajajo v obliki prepustnosti in absorbance. Če pa dobite vrednost jakosti svetlobe, lahko ti dve vrednosti izračunate tudi sami.
- Prehodnost (T) je mogoče določiti z deljenjem jakosti svetlobe, ki prehaja skozi raztopino vzorca, s količino svetlobe, ki prehaja skozi slepo raztopino. Ta vrednost je običajno izražena kot decimalno število ali odstotek. T = I/I0, kjer je I intenzivnost vzorca in I0 je intenzivnost slepega dela.
- Absorbanca (A) je izražena kot negativna osnova 10 logaritemska (eksponentna) prepustnost: A = -log10T. Torej, če je T = 0, 1, A = 1 (0, 1 je 10 na stopnjo -1). To pomeni, da 10% svetlobe preide, medtem ko se 90% absorbira. Medtem, če je T = 0,01, je A = 2 (0,01 je 10 na stopnjo -2). To pomeni, da je prepuščena svetloba 0,1%.
Korak 2. Grafirajte vrednost absorbance v primerjavi z valovno dolžino
Vrednost absorbance izrazite kot os y, valovno dolžino pa kot os x. Iz točk vseh rezultatov absorbance na vsaki valovni dolžini dobite spekter absorbance vzorca in določite vsebnost spojine in njeno razmerje v vzorcu.
Spekter absorbance ima običajno vrhove na določenih valovnih dolžinah. Te največje valovne dolžine vam omogočajo identifikacijo določenih spojin
Korak 3. Primerjajte svoj spekter absorbance z grafom znane spojine
Vsaka spojina ima edinstven spekter absorbance in ima pri vsaki meritvi vedno enako največjo valovno dolžino. Če primerjate graf, ki ga dobite z grafom določene znane spojine, lahko ugotovite vsebnost topljene snovi v raztopini vzorca.
