Obarvanje po Gramu je hitra tehnika in se uporablja za ugotavljanje prisotnosti bakterij v vzorcu tkiva in za razvrščanje bakterij kot gram-pozitivnih ali gram-negativnih na podlagi kemičnih in fizikalnih lastnosti njihovih celičnih sten. Madež po Gramu se skoraj vedno uporablja kot prvi korak pri diagnosticiranju bakterijske okužbe.
Ta tehnika barvanja je poimenovana po danskem znanstveniku Hansu Christianu Gramu (1853 - 1938), ki je tehniko razvil leta 1882 in jo leta 1884 objavil kot tehniko za razlikovanje med dvema vrstama bakterij s podobnimi kliničnimi simptomi: Streptococcus pneumoniae (znan tudi kot Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) in bakterija Klebsiella pneumoniae.
Korak
Metoda 1 od 3: Priprava diapozitiva za mikroskop
Korak 1. Pripravite se na delo v laboratoriju
Nosite rokavice in kravato za dolge lase, da preprečite bakterijsko okužbo vzorca, ki ga testirate. Očistite delovni prostor pod pokrovom ali v drugem dobro prezračevanem prostoru. Pred zagonom preverite gorilnik Bunsen in se prepričajte, da mikroskop deluje pravilno.
Korak 2. Sterilizirajte stekleno stekelce mikroskopa
Če je stekleno steklo umazano, ga operite z milnico, da odstranite olje in umazanijo. Diapozitive očistite z etanolom, čistilom za steklo ali drugo metodo, ki jo uporablja vaš laboratorij.
Korak 3. Vzorec položite na stekleno stekelce
S tehniko barvanja po Gramu lahko pomagate pri prepoznavanju bakterij v medicinskem vzorcu ali kulturi bakterij, ki rastejo v petrijevki. Za najboljše rezultate uporabite madež po Gramu na tanke poteze vzorca. Priporočljivo je, da uporabite vzorce, ki so stari manj kot 24 ur, saj so starejše bakterije morda poškodovale celične stene in se morda ne bodo odzvale na barvanje po Gramu.
- Če uporabljate vzorec tkiva, dodajte 1-2 kapljici na steklo. Enakomerno razporedite po steklu tako, da nastane tanka plast škropljenja vzorca, tako da ga potisnete po robu drugega sterilnega stekelca. Pustite, da se posuši, preden naredite naslednji korak.
- Če jemljete bakterije iz petrijevke, sterilizirajte inokulacijsko zanko v gorilniku Bunsen, dokler ne zasveti, nato pa pustite, da se ohladi. Z zanko kapnite sterilno vodo na stekelce, nato jo sterilizirajte in ponovno ohladite, preden jo uporabite za zbiranje majhnega vzorca bakterij. Po tem nežno premešajte.
- Bakterije, pripravljene v juhi, je treba ponovno mešati z vrtinčnikom, nato pa jih vzeti z inokulacijsko zanko, kot je opisano zgoraj, brez dodajanja vode.
- Če imate vzorec brisa (običajno narejen z majhnim ročajem z bombažnim vrhom), se ga dotaknite in nežno zavrtite po diapozitivu.
Korak 4. Nekoliko visoka temperatura lahko dobro razmaže
Toplota zadrži bakterije na vrhu stekelca, zato se med postopkom obarvanja ne raztopijo zlahka. Dvakrat do trikrat hitro tapnite drsnik po Bunsenovem gorilniku ali ga segrejte nad električnim grelnikom. Ne segrevajte, vzorec se lahko poškoduje. Če uporabljate gorilnik Bunsen, naj bo namesto velikega oranžnega plamena majhen, a modri plamen.
Druga možnost je, da se z metanolom naredi tudi bris z dodajanjem 1-2 kapljic metanola v suh bris, sušenje preostalega metanola na stekelcu pa se pusti na prostem. Ta tehnika zmanjšuje poškodbe celic in zagotavlja čisto ozadje slike diapozitiva
Korak 5. Postavite drsnik nad pladenj za barvanje
Pladnji za barvanje so izdelani iz kovine, stekla ali plitvih plastičnih plošč z mehko mrežico, ki obloži zgornji del. Na te mreže postavite diapozitive, da lahko tekočino, ki jo uporabljate, odteče v pladenj.
Če nimate pladnja za barvanje, lahko na plastični pladenj postavite diapozitiv za tiskanje kock ledu
Metoda 2 od 3: Postopek barvanja po Gramu
Korak 1. Prelijemo kristalno vijolično tekočino po brisu
S pipeto razpršite vzorec bakterije z nekaj kapljicami kristalno vijolične barve, znane tudi kot encijan vijolična. Pustite 30-60 sekund. Kristalno vijolična (KV) se v vodni raztopini loči na ione KV+ in klorid (Cl-). Ti ioni prodrejo v celične stene in celične membrane tako gram-pozitivnih kot gram-negativnih bakterij. KV+ ion sodeluje z negativno nabitimi komponentami bakterijskih celic in daje celicam vijolično barvo.
Mnogi laboratoriji uporabljajo kristalno vijolično "Hucker", ki vsebuje amonijev oksalat za preprečevanje padavin
Korak 2. Nežno sperite kristalno vijolično
Nagnite drsnik in s steklenico za pranje razpršite manjši curek destilirane vode ali vode iz pipe iz drsnika. Voda naj teče po površini brisa in je ne smete razpršiti neposredno po brisu. Ne izpirajte pretirano. Odstrani madeže pri gram -pozitivnih bakterijah.
Korak 3. Izperite bris z jodom, nato sperite
S kapalko sperite bris z jodom. Pustite delovati vsaj 60 sekund, nato pa previdno sperite na enak način kot zgoraj. Jod v obliki negativno nabitega iona medsebojno deluje s KV+ in tvori velik spojinski kompleks med kristalno vijolično in jodom (kompleks spojine CV-I) v notranji in zunanji plasti celice. Ta kompleks spojin bo obdržal vijolično barvo kristalno vijolične v celici na obarvanih mestih.
Jod je jedka snov. Izogibajte se vdihavanju, zaužitju ali stiku s kožo
Korak 4. Dodajte belilo in nato hitro sperite
Za ta pomemben korak se običajno uporablja mešanica acetona in etanola v razmerju 1: 1, ki jo je treba skrbno meriti. Postavite drsnik pod določenim kotom, nato dodajte belilo, dokler v vodi, ki se uporablja za izpiranje, ni več vidne vijolične barve. To običajno traja manj kot 10 sekund ali celo manj časa, če belilo vsebuje visoko koncentracijo acetona. Ta korak takoj ustavite, sicer bo barvilo iz kristalno vijolične barve izlužilo tudi gram-pozitivne in negativne celice, postopek barvanja pa je treba ponoviti. Odvečno belilo takoj sperite s prejšnjo tehniko.
- Kot nadomestek lahko uporabite čisti aceton (95%+). Čim več acetona uporabite, tem hitreje bo belilo delovalo, zato morate biti bolj pozorni na čas.
- Če imate težave pri spremljanju časa za ta korak, po kapljicah dodajte belilo.
Korak 5. Po brisu potresite protibarvanje, nato sperite
Pritrjevalni madež, običajno safranin ali fuksin, se uporablja za povečanje kontrasta med gram-negativnimi in gram-pozitivnimi bakterijami z obarvanjem razbarvanih (razbarvanih) bakterij, to je gram-negativnih bakterij, rožnate ali rdeče barve. Pustite vsaj 45 sekund, nato sperite.
Fuchsin bo intenzivno obarval številne gram-negativne bakterije, kot sta Haemophilus spp in Legionella spp. Ta metoda je dobra za začetnike
Korak 6. Posušite diapozitiv
Lahko jih posušite na prostem, da se posušijo, ali pa jih posušite z bibuloznim papirjem, ki se prodaja v ta namen. Postopek barvanja po Gramu je zaključen.
Metoda 3 od 3: Preverjanje rezultatov barvanja
Korak 1. Pripravite svetlobni mikroskop
Diapozitiv postavite pod mikroskop. Bakterije se zelo razlikujejo po velikosti, zato se bo skupno povečanje razlikovalo od 400x do 1000x. Za ostrejšo sliko je priporočljiva objektivna leča s potopnim oljem. Potopno olje spustite na drsnik in se izogibajte premikanju med kapljanjem, da preprečite nastanek mehurčkov. Premaknite ročaj leče mikroskopa, tako da leča zaskoči in se dotakne olja.
Potopitev v olje se lahko uporablja samo na posebej izdelanih lečah, ne pa na "suhih" lečah
Korak 2. Poskusite prepoznati gram -pozitivne in gram -negativne bakterije
Diapozitiv preglejte pod svetlobnim mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije imajo vijolično barvo, ker je kristalno vijolična ujeta v debeli celični steni. Gram-negativne bakterije bodo rožnate ali rdeče barve, ker se kristalno vijolična izpere skozi tanke celične stene, kamor vstopi rožnato barvilo.
- Če je vzorec predebel, je lahko rezultat lažno pozitiven. Obarvajte nov vzorec, če vsebuje vse gram -pozitivne bakterije, da se prepričate, ali je rezultat pravilen.
- Če uporabite preveč belila, je lahko rezultat lažno negativen. Obarvajte nov vzorec, če vsebuje vse gram -negativne bakterije, da se prepričate, ali je rezultat pravilen.
Korak 3. Primerjajte rezultate, ki jih vidite, z referenčno sliko
Če ne veste, kako izgledajo bakterije, preučite zbirko referenčnih slik, običajno razvrščenih po obliki in madežu po Gramu. Ogledate si lahko tudi spletne zbirke podatkov na [Nacionalna zbirka patogenov mikroorganizmov, Bakterije v fotografijah in na številnih drugih spletnih mestih. Za lažjo identifikacijo so spodaj primeri bakterij, s katerimi se pogosto srečujemo ali so pomembne za diagnozo, razvrščene glede na njihov status in obliko po Gramu.
Korak 4. Prepoznajte gram-pozitivne bakterije glede na njihovo obliko
Bakterije so nadalje razvrščene glede na obliko pod mikroskopom, najpogosteje kot koki (sferični) ali palice (cilindrični). Tu je nekaj primerov gram-pozitivnih bakterij (vijolične barve) glede na njihovo obliko:
- Gram pozitivni koki običajno stafilokoki (kar pomeni skupinski kokci) ali streptokoki (kar pomeni verižni koki).
- 'Gram pozitivne palice, kot so Bacillus, Clostridium, Corynebacterium in Listeria. Palecne bakterije Actinomyces spp. običajno imajo veje ali nitke.
Korak 5. Prepoznajte gram negativne bakterije
Gram-negativne bakterije (rožnate barve) so pogosto razvrščene v tri skupine. Koki so okrogle oblike, palice so dolge in tanke, kokoidne paličice pa vmes.
- Gram negativni koki Najpogostejša je Neisseria spp.
- Gram-negativne palice npr. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas in mnogi drugi. Vibrio cholerae lahko vidimo kot pravilno steblo ali upognjeno steblo.
- Gram-negativne bakterije "kokoidne" (ali "kokobacile") palice na primer Bordetella, Brucella, Haemophilus in Pasteurella
Korak 6. Previdno preverite, ali so rezultati mešani
Nekatere bakterije je težko natančno obarvati zaradi krhkosti ali voskaste narave njihovih celičnih sten. Te bakterije lahko pokažejo mešanico vijolične ali rožnate barve v isti celici ali med različnimi celicami v istem brisu. Bakterijski vzorci, starejši od 24 ur, lahko kažejo na to težavo, vendar obstajajo tudi nekatere vrste bakterij, ki jih je pri vsaki starosti vzorčenja težko obarvati. Te bakterije zahtevajo bolj specializirane teste za identifikacijo, kot so kislinsko hitro obarvanje, opazovanje v bakterijski kulturi, gojišče TSI ali genetsko testiranje.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium in Propionibacterium spp. vse so gram-pozitivne bakterije, vendar pogosto niso jasno obarvane.
- Majhne, vitke bakterije, kot so Treponema, Chlamydia in Rickettsia spp. težko obarvati po metodi Grama.
Korak 7. Odstranite preostali potrošni material in opremo
Ta postopek odstranjevanja odpadkov se med laboratoriji razlikuje in je odvisen od uporabljenih materialov. Običajno se tekočina v pladnju za obarvanje odstrani v steklenice, označene kot nevarni odpadki. Diapozitive namočite v 10% raztopino belila in jih zavrzite v posodo za ostre predmete.
Nasveti
- Ne pozabite, da bodo rezultati madežev po Gramu dobri le, če je vzorec dober. Pomembno je, da bolnike obvestite, da lahko zagotovijo dober vzorec (npr. Razlika med pljuvanjem in globokim kašljem za pridobitev vzorca sputuma).
- Kot barvilo za beljenje etanol reagira počasneje kot aceton.
- Upoštevajte standardne laboratorijske predpise, da zagotovite varnost.
- Za vadbo uporabite bris za lica, ker vsebuje gram-pozitivne in gram-negativne bakterije. Če vidite samo eno vrsto bakterij, morda uporabljate premalo ali preveč belila.
- Za pritrditev drsnika lahko uporabite lesene zaponke.
Opozorilo
- Aceton in etanol sta vnetljivi snovi. Aceton bo odstranil olje iz vaših rok, zaradi česar bo vaša koža lažje absorbirala druge kemikalije. Nosite rokavice in jih previdno uporabljajte.
- Ne pustite, da se bris razsuši, preden sperite madež po Gramu ali madež.
Kaj rabiš
- Omrežni vzorec
- Stekleni tobogan
- Pipeta
- Majhen vir ognja, ali drsni grelec, ali metanol
- Voda
- Kristalno vijolična
- Jod
- Barvno belilo, na primer alkohol ali aceton
- Safranin
